一、适用范围
适用于实验室从事琼脂糖凝胶电泳实验的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
在开始实验前请认真阅读完该规程,尤其是注意事项,确保在开始实验前准备好所需实验试剂和仪器。
(一)配制1X TBE or TAE buffer
1、配制1X TBE (1000ml) 或者 1X TAE (1000ml)
取100ml 10X TBE 或者10X TAE ,用 900ml 去离子水稀释
2、配制 1.5% TBE 或 TAE agarose gel
带上手套,准确称取1.5g agarose 于250ml锥形瓶中,往锥形瓶中加入100ml 1X TAE (or TBE) buffer,用玻璃棒混匀。用微波炉加热使之溶化,在加热的过程中用玻璃棒混匀几次直到溶液澄清透明,无絮状物。
注意事项:加热时不要让琼脂糖凝胶溢出瓶外,检查琼脂糖是否已经完全溶解(溶液澄清透明,无絮状物即可,不可过度加热),加热时带上耐热手套。
3、待锥形瓶内琼脂糖温度降到45-50℃时,加入5ul EB染料使终浓度为10mg/ml,混匀后轻轻导入制胶板内,插上梳子,注意避免产生气泡,等待胶的凝固。
注意事项:EB具有强烈的致癌性,操作时需带手套,操作完后手套与含有EB的胶需放在专门的化学容器内,需经特需处理。
4、清洗锥形瓶,处理残留的含有EB的琼脂糖凝胶
5、为确保加样孔不被损坏,需小心的拔出梳子。把胶放入电泳槽内,往电泳槽内加入电泳液(1 x TAE or TBE buffer),超过胶面0.5cm即可。为确保胶的位置放置正确,加样孔应在负极(黑色)位置。
(二)上样与电泳
1、在上样或将凝胶放入电泳槽之前确保电源必须关闭,不要放置其它设备在电泳仪和电源器旁边。
2、将样品与上样缓冲液以一定的比例混合(一般5:1),混匀,小心的将样品加入上样孔中,加入DNA maker。
3、盖上电泳槽盖子,确保电泳槽正负极与电源正负极对接正确。打开电源开关,调节电压(一般80-120V)与电泳时间。若需要恒流跑胶,则调节电流到所需值。
注意:在该过程中不要用手触摸缓冲液,电泳时电泳槽正负极有气泡冒出时说明仪器正在正常运转。
4、一但样品跑到适当位置,关掉电源,打开电泳槽槽盖,小心拿出琼脂糖凝胶,避免断裂。
5、凝胶图像保存:在凝胶成像系统里面将脱色好的凝胶摄像。
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